新冠病毒变异,PCR建设迫在眉睫
栏目:行业动态 发布时间:2020-12-21
PCR核酸病毒检测实验室建设知识

近日,英国又爆出新冠病毒变异毒株,并且伦敦也将因此再度封城,这又给本来就苍白无力的世界局势蒙上了一层迷雾。恐怕世界要回到正轨道路又将变得更坎坷曲折了。

全球新冠病毒疫情爆发以来,我国在内防反弹,外防输入作战方针指导下,各地都在加紧了PCR核酸检测实验室的建设,以达到要求的检测能力。PCR实验室作为一个特殊的具有一定生物安全危害的场所必然有其特殊的要求。

要完成一组PCR核酸病毒检测实验,通常需要经过试剂配制、样品处理、核酸扩增和产物分析4个实验过程。按照互不干扰互不污染的原则,这4个实验过程的实验用房应相邻布置,组成一个独立的PCR实验区。标准的PCR实验区包括:试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区、各区配套的缓冲区及公共走廊。

PCR实验室整体平面布局.

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整个区域有一个公用走廊,每个独立实验区设有专门的缓冲区。通过压差控制,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并且降低扩增产物对人员和环境的污染

试剂准备区(15m2~20m2)

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂试,配备有2~8°C冰箱和-80°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。本区的压力梯度要求为:相对正压状态,以防止外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染。

  

标本制备区(25m2~30m2

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNADNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNAcDNA的合成。标本制备区配备有2~8°C冰箱和-20°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。在标本制备区,还需要配备生物安全柜,用于进行提取核酸的操作。为避免提取的核酸在柜内反复循环,造成标本之间的交叉污染,出现假阳性结果,该区域配备的生物安全柜必须是B2型的。生物安全柜工作区垂直气流全部来自实验室,排风经过高效过滤器过滤后直接排至室外,不允许回到安全柜和实验室中。本区的压力梯度要求为:相对于试剂准备区为负压,相对于扩增区为正压,以避免污染试剂区同时避免从扩增区进入本区的气溶胶污染。

 

扩增室(15m2~20m2)

该区域主要进行的操作为DNAcDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。
在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。扩增室主要配备PCR实验室的核心仪器PCR仪,本文实例中使用了ABI7500ABI9700两种PCR仪。在实验室建造过程中,需要给PCR仪配备专门的UPS电源,以保证其正常工作。。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。本区的压力梯度要求为:相对于制备区为负压,相对于产物分析为正压。

 

产物分析区(15m²~20m²)

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。在室内配备通风橱,保证房间内的相对负压,空气从室外流向室内。本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。

·         工作区域的严格划分,各个实验区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

·         合理的系统设置,合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统;严格的气流压力控制,保证不同的实验区内不同的压力要求。

·         规范的操作,临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训,在实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。清洁工作及时、正确。实验工作结束后,必须立即对本区进行清洁。

·         严格的管理:严格控制进出实验室的人员。在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服(如不同颜色),当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域;尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等;